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细胞培养实战经验:一般操作、离心、复苏、换液、洗细胞、消化、传代
点击次数:623 发布时间:2018-07-11

培养液按说明书讲是要避光的,但从4摄氏度冰箱拿出来一起照台,刚好温度升上去,而且紫外线不透塑料,所以就拿去照吧。胰酶也说要4摄氏度保存,但同样存在一个升温的问题,尤其是胰酶的消化温度,所以也拿去照台。

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细胞就不要拿去照台了,也不喷酒精,以免倒置显微镜下看不清楚,沾湿的瓶口也更容易沾上脏东西。照台前,先往超净台喷一遍酒精,放完物品可以再喷一次。照完台,关紫外灯,开白灯,开风机,ZUI低档风速即可,戴上手套,手套喷酒精,操作前,先点酒精灯,再用酒精纱布擦擦台面,擦完的干净台面上可以放瓶盖,瓶盖凹面不能向上,侧放,不行的话就将瓶盖盖在干净的台面上。开小培养瓶的瓶盖,可以手掌小鱼际固定、压住平放的培养瓶瓶身,拇指和食指拧开瓶盖,达到单手操作的效果,拧上的时候也一样。

滴管不用的时候夹在无名指和中指之间,保持水平,避免污染。开盖后的培养瓶,不要竖立,往培养瓶中加液体时拿着培养瓶也是斜放。滴管的液体尽量避免沾到瓶口,因为血清的存在所以完全培养基会产生气泡,滴管不要排空就不会把滴管内的气泡带入培养瓶或沾在滴管口,滴管口不沾气泡则在出瓶口时不容易沾到瓶口。滴管出瓶口的时候,要快进快出,要悬着一个念头,念头悬着进而注意力更集中、动作更快。

低速离心机:细胞离心应选择较低的转速,避免对细胞的物理损伤,个人习惯用1000r/min,一般离心5分钟。差速离心技术的应用十分普遍,尤其是针对有生物活性的物质,如动植物病毒、各种亚细胞组分(细胞核、叶绿体、线粒体等),以及核酸和蛋白质等生物大分子的分离、粗提和浓缩。

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复苏:先让水浴锅的温度达到37摄氏度左右,从低温区取出冻存的细胞后马上投入水浴中。复苏的关键是快速解冻。将冻存的细胞吸到离心管中,加入一定量完全培养液后离心,是为了去除冻存液中的DMSO。直接吸取1ml冻存液到25平方厘米的培养瓶中,再加完全培养基到5ml,则DMSO的终浓度为2%,这个浓度的DMSO还是会在一定程度上抑制细胞生长。不经过离心去除DMSO,不是说一定不可以,只是后果自负。

换液:当培养液变黄时,说明细胞生长旺盛,一定要换液,快长满了就传代或冻存。当培养液较脏时,比如漂浮较多死细胞,一般出现在复苏或传代后的第二天、以及常规生长细胞的第二三天,也要及时换液。

洗细胞:当培养瓶中出现较多死细胞、细胞碎片或其他杂质时,就要清洗一下。但注意用吸管加入PBS或生理盐水时,要对着培养瓶侧壁,以免冲刷掉瓶底的部分细胞。加入PBS或生理盐水后,盖上盖子,在台面上摇晃几下,注意不要把液体溅起来或沾到培养瓶顶面。能用PBS洗较好,虽然PBS的主要成分是氯化钠,但具有pH缓冲作用,用无菌生理盐水洗细胞也可,优点是比较便宜。

倒置显微镜

消化:个人经验是先摸时间,一劳永逸,以后对于同一种细胞到时间了就赶紧加完全培养基终止消化。一般消化2分钟就行了,在此基础上增减消化的时间。也有人建议在倒置显微镜下观察,等大部分贴壁细胞收缩后就停止消化,但个人认为这是多此一举,而且很难把握一个度。吹打细胞要有节奏,动作要熟练,吸的时候要在液面下吸,吹的时候要对着瓶底没液平的地方吹,吸的时候不要吸到气体、吹的时候不要吹入液体平面下,这样就基本不会产生气泡。

传代:常用1:2传代,这样才有足够的细胞密度。不离心再重悬细胞,虽然避免了离心和重悬对细胞的损伤,减少了几个步骤,减少污染,但吸掉胰酶的中和液后很容易丢失一部分细胞,甚至丢失大部分细胞,对于初学者不太适用。刚传代的细胞,若在倒置显微镜下观察到分布不均匀、有细胞团,就要及时晃匀。

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